Engineering 3D microenvironments for the generation of functional, pre-vascularized human beige adipose tissue: from ex vivo organoid model to transplantable micro-tissue
Ingénierie de micro-environnements 3D pour la génération de tissus adipeux beiges humains fonctionnels et pré-vascularisés: du modèle organoïde ex vivo au micro-tissu transplantable
Résumé
Cells in tissues and organs are organized within complex 3D environments surrounded by neighboring
cells, extracellular matrices, and dynamic chemical gradients. Advancing methods to develop relevant
3D models of functional human adult tissue represents a pivotal challenge in Biosciences. These tissue
constructs serve as enhanced models to advance basic science or to screen therapeutic targets as well
as advanced therapy medicinal products to favor tissue regeneration or to support organ with
defective function.
In this thesis, we aimed to engineer defined 3D microenvironment to generate multi-purposes 3D adult
tissue models. We specifically focused on human beige adipose tissues (AT). Due to their unique
properties in energy dissipation, increasing beige AT activity by pharmacotherapy or cell-based
transplantations holds therapeutic promises to face obesity and diabetes pandemics. However, in vitro
3D relevant models of human beige AT are currently lacking which hinder research into these tissues
and biotherapy development. During this thesis, we developed an innovative method to generate
functional and vascularized beige adipose organoids using human stromal vascular fraction (SVF) of
white adipose tissue as a source of adipose derived stromal cells (ASC) and endothelial progenitors.
We engineered defined chemical and biomechanical environment, applicable at multiple tissue scales,
to drive self-organization of spheroids. Embedding of spheroids in GelMA hydrogel was used to
promote cell viability and cell organization. GelMA volume and GelMA percentage were optimized to
favor cell colonization and cell viability. Translating from 2D to 3D culture, inhibition of TGFβ pathway
was also key to promote beige adipogenesis while maintain vascular formation from amplified SVF
cells-spheroids. Combination of GelMA environment and beige adipogenic medium promoted
generation of beige adipose organoids containing beige adipocyte and vascular compartment
mirroring native tissue architecture from both amplified and fresh SVF cells. These organoids display
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key features of native beige AT including inducible UCP1 expression, increased uncoupled
mitochondrial respiration and batokines secretion.
To scale up beige adipose organoid generation toward micro-tissue, we developed GelMA molding
and spheroid patterning to replicate environment specified at the individual spheroid level within a
multi-spheroid setting. This led to the generation of beige adipose micro-tissue containing embedded
vasculature without hindering beige adipocyte differentiation level and cell viability. Preliminary
transplantation assays of these microtissue in healthy NSG mice showed efficient integration of human
vessels in host vasculature with promising maintenance of human cell viability.
Finally, we also explored technological approaches to generate cell culture system allowing for a better
examination of how microenvironment parameters drive cell organization in 3D matrices.
Our approach represents significant advances in developing in vitro human beige AT models and
facilitates broad applications ranging from basic research to biotherapies. Given multipotency of ASC
and tunability of GelMA hydrogels, this engineering method could be transposable to other tissues
highlighting the potential of this system to address essential aspects of tissue generation beyond
adipose tissue.
Au sein des tissus, les cellules s'organisent dans des microenvironnements 3D complexes, composés de leur cellules voisines, de matrice extracellulaire et de gradients chimiques dynamiques. Développer des modèles 3D fonctionnels de tissus adultes humains représente un défi important dans le domaine des biosciences. Ces constructions tissulaires servent de modèles améliorés pour faire progresser la recherche fondamentale, pour identifier des cibles thérapeutiques, ainsi qu’en tant que médicaments avancés de thérapie innovantes.
L’objectif de cette thèse a été de définir un microenvironnement 3D permettant la génération de modèles 3D polyvalents de tissus adultes. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux tissus adipeux (TA) beiges humains. L'augmentation de l'activité des TA beiges par pharmacothérapie ou greffes cellulaires représente une approche thérapeutique prometteuse pour faire face à la montée de l’obésité et du diabète. Cependant, les modèles in vitro de tissu adipeux beige humain sont rares, ce qui entrave la recherche sur ces tissus et le développement de biothérapies. Au cours de cette thèse, nous avons développé une approche d’ingénierie innovante permettant la génération d’organoïdes adipeux beiges fonctionnels et vascularisés dérivé de la fraction vasculaire stromale humaine (S! VF) du tissu adipeux blanc. Nous avons défini un environnement chimique et biomécanique précis, applicable à différentes échelles tissulaires, pour guider l'auto-organisation de sphéroïdes, maintenu dans un hydrogel dérivé de gélatine (GelMA), vers l’émergence d’organoïde fonctionnel.L'assemblage contrôlé de ces sphéroïdes permet de transposer la morphogenèse des organoïdes à une échelle centimétrique, permettant la création de micro-tissus adipeux beiges vascularisés transplantable. Par ailleurs, nous avons exploré des solutions technologiquespouvant permettre d’examiner plus précisément l’influence des paramètres du microenvironnement sur l'organisation cellulaire au sein de matrices 3D.
Les cultures ont été caractérisées par microscopie confocale et au niveau moléculaire. L'inhibition de la voie TGFβ s'est avérée essentielle dans les cultures 3D afin de favoriser l'abiogenèse beige et la formation vasculaire. L’encapsulation des sphéroïdes dans le GelMA a été utilisée pour favoriser le maintien et l'organisation cellulaire. Le volume et le pourcentage de GelMA ont été optimisés pour favoriser la colonisation et la viabilité des cellules. La combinaison de l’environnement biomécanique de GelMA et biochimique du milieu de différentiation a permis la génération d'organoïdes adipeux beiges vascularisés mimant l’architecture des tissus natifs à partir de cellules de SVF amplifiées ou fraîchement isolées. Ces organoïdes présentent des caractéristiques clés des TA&nbs! p;beiges natifs, notamment l'expression inductible d'UCP1, une augmentation de la respiration mitochondriale découplée et la sécrétion de batokines. La transposition de l’environnement spécifié au niveau d’un sphéroïde à un contexte multi-sphéroïdes a conduit à la génération de micro-tissus adipeux beige vascularisé sans impacter la différentiation adipocytaire et la viabilité cellulaire. Des premiers essais de transplantation de ces micro-tissus dans des souris NSG saines ont montré une intégration efficace des vaisseaux humain dans la vascularisation murine associée à un maintien prometteur de la viabilité des cellules humaines.
Notre approche constitue une avancée majeure dans la création de modèles 3D de tissu adipeux beige humain in vitro, permettant une variété d'applications allant de la recherche fondamentale aux biothérapies. Compte tenu de la multipotence des ASC et du caractère modulable des hydrogels de GelMA, cette méthode d'ingénierie pourrait être transposée à d'autres tissus, démontrant le potentiel de ce système pour aborder des aspects essentiels de la génération de tissus au-delà du tissu adipeux.
| Origine | Fichiers produits par l'(les) auteur(s) |
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